Осенью 1939 г. в НИИ ВВС на базе авиационной эскадрильи боевого применения была сформирована отдельная эскадрилья для ведения боевых действий в сложных метеоусловиях на Финском фронте (десять самолетов СБ и ДБ-3; летчики; В.И. Жданов, Н.П. Пискунов, М.П. Субботин, Н.В. Крутиков, А.А. Живописцев, Ф.Ф. Опадчий ; штурманы С.С. Кириченко, Королев; инженеры Л.И.Лось, А.Н. Ларченко, И.В. Часовиков), которая затем была преобразована в 85-й авиационный полк особого назначения ВВС Северо-Западного фронта (командир Б.В.Стерлингов).

В 1940 г. группа летного и инженерно-технического состава Института под руководством летчика-испытателя С.П.Супруна действовала в Китае, обеспечивая ПВО Чунцина. Работа все группы получила высокую оценку, а С.П. Супрун был удостоен звания Героя Советского Союза.

Сложная международная обстановка оказала влияние на организационную перестройку подразделений НИИ ВВС. Было проведено три организационно-штатных изменения в результате которых в 1941 году Институт состоял из следующих подразделений:
-   командование, политотдел и штаб;
-   авиационная эскадрилья боевого применения и научных исследований ;
-   17 отделов;
-   опытный завод;
-   санитарная служба и финансово-плановое отделение;
-   705-я авиационная база.

Основная работа Института проходила в Чкаловской (после гибели В.П. Чкалова аэродром Щелково получил новое название), где были введены в строй все запланированные к постройке здания и сооружения, за исключением аэродинамической лаборатории, приступившей к работе в мае 1941 г.

В 1940 г. в НИИ ВВС начались Государственные испытания истребителей-монопланов И-26 (Як-1), И-301 (ЛаГГ-1), И-200 (МиГ-1).

С 1 по 19 апреля 1940 г. в НИИ ВВС проходил испытание бронированный штурмовик БШ-2 (Ил-2) конструкции С.В. Ильюшина.

К маю 1941 г. НИИ ВВС РККА имел следующую структуру: командование, штаб, политотдел, 1-й отдел - научно-технический, 2-й отдел - аэродинамических испытаний, 3-й отдел — опытных самолетов, 4-й отдел - испытаний опытных серий самолетов и боевого применения; группа отделов моторов и топлива, группа отделов специальных служб, опытный завод, санитарная служба, финансово-плановое отделение.

7 мая 1941 г. в Кремле у Сталина состоялось совещание представителей высшего командования ВВС РККА и руководства НКАП. На этом совещании предельно резко о недопустимости передачи на Государственные испытания самолетов, не прошедших заводские испытания, а также по ряду других актуальных вопросов высказался начальник НИИ ВВС А.И. Филин. Через полмесяца Филина арестовали, репрессии обрушились и на других сотрудников НИИ ВВС. Вместо Филина начальником НИИ ВВС назначили И.Ф. Петрова.

Война началась 22 июня, а 23 июня С.П. Супрун как депутат Верховного Совета СССР смог попасть на прием к Ворошилову, Молотову и Калинину. От имени командования НИИ ВВС С.П. Супрун обратился к руководителям страны с предложением о формировании авиаполков, укомплектованных испытателями и вооруженных новейшими самолетами. Решение о формировании шести авиаполков было принято 27 июня. Предстояло сформировать три истребительных полка (401-й, 402-й, 403-й ), два полка пикирующих бомбардировщиков (410-й и 411-й ), полк тяжелых бомбардировщиков (412-й, с августа 1941 г. — 432-й), один полк штурмовиков (430-й ), а также одну разведывательную эскадрилью (38-я ), три батальона аэродромного обслуживания (760-й, 761-й, 762-й ). В состав этих частей и подразделений вошли 303 человека из числа лучших летчиков, инженеров, техников и механиков института. 29 июня по вопросу о формировании «испытательных» полков Сталин вызвал П.М. Стефановского, С.П. Супруна и А.И. Кабанова.

401-й истребительный авиаполк (командир С.П. Супрун) начал свой боевой путь 30 июня 1941 г. на Западном фронте (аэродром Зубово, район Орши); 4 июля С.П. Супрун погиб в воздушном бою. 402-й истребительный авиаполк (командир П.М. Стефановский) начал свой боевой путь также 30 июня 1941 г. на Северо-Западном фронте (аэродром Идрица ). Полк, хотя и не стал гвардейским, но сбил самолетов противника за годы войны больше, чем любой другой авиаполк советских ВВС. Ныне часть, являющая наследником прославленного полка входит в состав Липецкого Авиацентра.

Летчики и инженеры НИИ ВВС в 1940 г. были командированы в Германию для изучения и отбора к закупке авиационной техники. В кабине истребителя Не-100 С.П. Супрун

430-й разведывательно-штурмовой авиаполк (командир Н.И. Малышев) получил Ил-2 на заводе в Воронеже и вылетел на фронт 5 июля. Уже в первых боях полк понес тяжелейшие потери и через месяц был переформирован в разведывательную эскадрилью, которая действовала в интересах штаба Западного фронта. Позже эскадрилью преобразовали сначала в 3-й, а потом в 10-й отдельный разведывательный авиаполк. Войну 10-й отдельный Московско-Кенигсбергский Краснознаменный разведывательный авиаполк закончил в Восточной Пруссии.

Формирование 412-го дальнебомбардировочного авиаполка (командир В.И. Лебедев) началось 7 июля, шло оно долго и очень непросто - корабли ТБ-7 собирали по всей стране. Значительную часть личного состава полка составили опытнейшие пилоты и штурманы ГВФ и Полярной авиации. Войну полк завершил как 25-й гвардейский Орловский. В ВВС РФ прямым наследником 432-го бап является 203-й отдельный гвардейский Орловский авиационный полк (самолетов-заправщиков).

В связи с приближением линии фронта к Москве правительство приняло решение перебазировать НИИ ВВС в Свердловск на аэродром Кольцово. В Чкаловской были оставлены некоторые цеха опытного завода, аэродинамическая лаборатория, подсобное хозяйство 705-ой авиабазы, а также группа специалистов, необходимых для продолжения испытаний и комендатура для охраны имущества. Осенью 1941 г. в связи с угрозой захвата аэродрома германскими войсками ключевые объекты были заминированы.

В Кольцове продолжались испытания новых образцов авиационной техники. Учитывая важность этих работ, в конце 1941 г. и в начале 1942 г. из действующих частей было отозвано на испытательную работу 155 бывших работников НИИ ВВС. 401-й и 410-й полки расформировали, остальные стали обычными, «строевыми» частями.